La stérilisation en cuve réelle (véritable stérilisation) est un processus de stérilisation dans lequel tout le milieu de culture préparé est introduit dans un bioréacteur-fermenteur ou autre dispositif, de la vapeur est introduite pour chauffer le milieu de culture et l'équipement utilisé à la température de stérilisation, maintenue pendant un certain temps, puis refroidie à la température d'inoculation, comme le montre la figure 1.
Figure 1 Diagramme schématique de l'élimination réelle
Ce processus est également appelé stérilisation intermittente ou stérilisation par lots (par rapport à la stérilisation continue).
L’opération de stérilisation d’un réservoir plein comprend en fait trois processus : le chauffage, la conservation de la chaleur et le refroidissement. La figure 2 montre les changements de température lors de la stérilisation en réservoir plein du milieu de culture.
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Figure 2 Changements de température pendant la stérilisation des boîtes
Étapes spécifiques à la stérilisation des canettes :
1. Inspection du nettoyage des réservoirs
Avant le nettoyage, vérifiez si l'état de la vanne est correct. Lors du nettoyage, veillez à vérifier s'il y a des fuites dans l'équipement et les canalisations, principalement les canalisations de refroidissement.
Vérifiez si l'eau condensée dans la chemise du fermenteur a été évacuée pour vous assurer qu'il n'y a pas d'eau de refroidissement dans la chemise.
Après le nettoyage, vérifiez l'intérieur du réservoir pour voir la couleur d'origine sans saleté évidente.
2. Préparation avant stérilisation
Stérilisez le filtre à air du fermenteur et séchez-le avec de l'air stérile.
Assurez-vous que le réservoir est dépressurisé. Insérez l'électrode nettoyée et calibrée dans le réservoir et connectez le fil de l'électrode. Vérifiez que la vanne du fond du réservoir est fermée.
Ajoutez ensuite les matériaux préparés dans le réservoir, ajoutez l'eau requise pour compléter le volume selon les exigences du processus, ajoutez l'antimousse et vérifiez s'il manque du matériel. Une fois terminé, remuez pour éviter que le liquide ne se dépose.
3. Chauffage
(1) Chauffage indirect
Ouvrez les vannes d'échappement du corps du réservoir, en même temps, fermez l'eau de refroidissement de la chemise, ouvrez la vanne de vapeur de la chemise ou du serpentin, introduisez de la vapeur dans la chemise ou le serpentin pour chauffer indirectement le liquide, ouvrez légèrement le drain du tuyau d'entrée d'eau de la chemise. vanne et évacuer l'eau condensée dans le corps et la chemise du réservoir.
Lorsque la température du réservoir atteint 80-90℃, fermez progressivement la soupape d'échappement.
Le rôle du préchauffage de la vapeur des chemises :
①Réduisez la génération d'eau condensée et assurez l'exactitude du volume du milieu de culture après désinfection.
Au début, la vapeur est directement introduite dans le réservoir et la matière froide dans le réservoir est directement précipitée dans la vapeur, ce qui est très susceptible de produire une grande quantité d'eau condensée et de rendre le volume du milieu de culture trop important après consommation. . Certaines usines omettent cette étape et doivent contrôler la quantité d’eau condensée générée par les expériences pour garantir la concentration du milieu de culture.
②Réduisez le bruit.
La différence de température entre le matériau et la vapeur est trop importante et l'introduction directe de vapeur provoquera des vibrations dans l'équipement.
③ Il est propice à la gélatinisation et à la liquéfaction des matières premières féculentes. (Cela ne s'applique pas aux matières premières sans amidon)
La température de l'enveloppe augmente relativement lentement, ce qui favorise la dissolution complète des matériaux qui peuvent ne pas être complètement dissous dans le milieu de culture pour les matériaux amylacés, et évite la gélatinisation et l'agglomération de la surface du matériau provoquées par une élévation de température trop rapide, qui affecte l'effet de stérilisation.
(2) Chauffage direct
Après avoir préchauffé la chemise à 80-90 ℃ , fermez la vanne d'entrée de vapeur de la chemise (elle peut également être fermée), ouvrez la vanne d'entrée de vapeur du réservoir et laissez la vapeur s'écouler directement dans le réservoir pour augmenter la température du réservoir à 118-121 ℃. . Ouvrez diverses vannes d'échappement et arrêtez de remuer.
4. Isolation thermique et sous pression
Lorsque la température du matériau est proche de la température spécifiée par le processus, réduisez progressivement la vanne de vapeur et ajustez l'équilibre de chaque vanne pour que la pression et la température atteignent régulièrement la pression et la température requises par le processus (généralement légèrement supérieures à la température de culture). de 0,5 à 2 ℃, sinon il descendra trop bas).
A ce moment, toutes les canalisations reliées au réacteur doivent être dans deux états : entrée vapeur ou sortie vapeur, afin de stériliser les canalisations.
Pendant la phase d'isolation, de la vapeur doit être introduite dans tous les tuyaux en dessous du niveau liquide du milieu de culture ; la vapeur doit être évacuée des autres tuyaux au-dessus du niveau du liquide, afin d'assurer une stérilisation complète sans coins morts. L'isolation est généralement de 121 ℃ pendant 25 à 30 minutes.
de fermentation générales comportent généralement trois ouvertures (tuyau d'entrée d'air, tuyau d'évacuation et tuyau d'échantillonnage) pour l'admission de vapeur, ce qu'on appelle « l'entrée de vapeur à trois voies ».
« Sortie de vapeur à quatre voies » signifie que la vapeur est directement évacuée des tuyaux d'échappement, d'inoculation, d'alimentation et antimousse. Principalement de ces quatre manières, les vannes d'entrée et de sortie de vapeur doivent également être ouvertes.
5. Refroidissement
Après la stérilisation, fermez d'abord toutes les vannes d'entrée de vapeur et réduisez légèrement la vanne d'échappement. Ensuite, ouvrez la vanne d’entrée d’air pour laisser entrer l’air stérile afin de maintenir la pression du réservoir. Il est à noter que la pression dans la cuve doit être inférieure à la pression du filtre à air pour éviter que le milieu de culture ne reflue.
Enfin, ouvrez la vanne d'eau de refroidissement et faites passer de l'eau froide à travers la chemise ou le serpentin pour un refroidissement rapide, commencez à remuer et refroidissez le milieu de culture à la température requise par le processus de fermentation .
Après la stérilisation, de l'air stérile doit être introduit à temps pour garantir la pression à l'intérieur du réservoir (généralement la pression du réservoir est ajustée à 0,1 MPa) avant d'ajouter de l'eau de refroidissement pour le refroidissement.
La fonction de l'introduction d'air stérile est d'accélérer le refroidissement et de maintenir la pression positive dans le réservoir, pour empêcher le refroidissement du milieu de culture de former une pression négative dans le réservoir, ce qui est facile d'être infecté par des bactéries ou de provoquer le bioréacteur. fermenteur soit endommagé (la pression de la cuve du bioréacteur-fermenteur tombe à zéro et le corps de la cuve est aspiré à plat). Il s’agit d’un accident qui se produit souvent lors des opérations de stérilisation des cuves de fermentation à double enveloppe en acier inoxydable . Il s'agit d'un grave accident de production.
Les quatre critères suivants permettent de juger de la qualité de la stérilisation des cuves de milieu de culture :
① Répondre aux exigences de stérilité après la stérilisation ;
②Moins de destruction des nutriments ;
③ Le volume du milieu de culture après stérilisation est cohérent avec le volume de l'aliment ;
④Moins de mousse.
Plusieurs points doivent être pris en compte lors du processus de stérilisation :
(1) Le rôle de l'agitation de stérilisation
Dans la stérilisation en boîte pleine, l'agitation joue un rôle très important.
Le but de l'activation de l'agitation :
① Faites en sorte que les matériaux stérilisés soient chauffés et transférés uniformément pour éviter la formation de fausse pression pendant le processus de stérilisation de la boîte ;
② Évitez la sédimentation des matériaux. Une fois que la sédimentation et la stratification se produisent, cela entraînera une température de chauffage incohérente et générera facilement une fausse pression.
(2) Modifications du volume de liquide après stérilisation
Lors de la préparation du milieu de culture, il convient de tenir pleinement compte de l'augmentation du volume du milieu de culture après stérilisation.
Plus le temps de stérilisation est long, plus le volume augmente. Plus la température est basse, plus le volume de vapeur entrant est important, augmentant généralement d'environ 10 %, ce qui est lié à la qualité de la vapeur.
La chemise n'est pas préchauffée ou insuffisamment préchauffée, l'eau condensée dans le tuyau de vapeur n'est pas complètement évacuée, la vapeur envoyée depuis la chaufferie contient trop d'eau, etc., ce qui va former beaucoup d'eau condensée et augmenter le volume.
(3) Prise en compte du temps de stérilisation des canettes
Dans la production industrielle de fermentation , l’étape de conservation de la chaleur est généralement considérée comme la durée de stérilisation. Désormais, 121 ℃ et 30 minutes sont généralement utilisés.
Cependant, le temps de maintien de la stérilisation nécessaire pour obtenir le même effet de stérilisation dans des fermenteurs de différentes tailles est théoriquement différent.
Le 40m 3 le bioréacteur-fermenteur est stérilisé et le temps théorique de stérilisation est calculé par la formule
Figure 4 Calculer le temps théorique de stérilisation.
t--indique le temps théorique de stérilisation, s ;
N0 —— le nombre initial de bactéries viables au début de la stérilisation (t=0), cellules/mL ;
Nt —— Nombre de bactéries vivantes restantes après le temps t, cellules/mL ;
k——constante du taux de mortalité bactérienne, s-1, qui est liée au type de micro-organisme et à la température.
Supposons que le milieu de culture contient 2 × 107 spores de bactéries résistantes à la chaleur/mL et que la constante du taux de stérilisation à 121 ℃ est de 0,0287 s-1.
Le temps nécessaire pour obtenir une probabilité d'échec de stérilisation de 0,001 est de 23,9 minutes. L'effet de stérilisation des deux étapes du milieu de culture passant de la température ambiante à 121 ℃ et descendant de 121 ℃ à la température de culture de fermentation n'est pas pris en compte ici.
En fait, le chauffage et l'augmentation de la température contribuent à la stérilisation du milieu de culture, surtout lorsque le milieu de culture est chauffé au-dessus de 100 ℃ , cet effet est plus évident.
Si l'effet de stérilisation du milieu de culture pendant la phase de chauffage est pris en compte et s'il faut 15 minutes pour augmenter la température du milieu de culture de 100 ℃ à 121 ℃ , le temps de stérilisation pendant la phase d'isolation est calculé comme étant de 21,1 minutes, et le temps d'isolation est raccourci de 12%.
Plus le volume de la cuve de fermentation est grand , plus le temps de chauffage pour la stérilisation de la cuve est long, plus l'impact de l'étape de chauffage sur la stérilisation est grand et plus le temps d'isolation correspondant est court.
Les petits réservoirs chauffent rapidement et le temps de chauffage peut être ignoré. Les cuves de fermentation actuellement utilisées dans l' industrie de la fermentation sont relativement grandes (60 à 100 m3) et l'effet de stérilisation pendant la phase de chauffage doit être pris en compte pour minimiser la destruction des nutriments.
Pour les cuves de fermentation d’un volume inférieur à 40 m3, cet effet peut être ignoré.
En outre, l'étape de refroidissement contribue également dans une certaine mesure à la stérilisation, mais des mesures de refroidissement rapide sont couramment utilisées de nos jours, qui sont courtes dans le temps et ne sont généralement pas prises en compte dans les calculs.
